Astratto – L’imaging come mezzo di archiviazione dei dati scientifici si è evoluto rapidamente nel secolo scorso dai disegni a mano, alla fotografia, alle immagini digitali. Solo di recente è possibile acquisire, archiviare ed elaborare set di dati sufficientemente grandi in modo tale che la digitalizzazione dei tessuti possa effettivamente rivelare più che l’osservazione diretta del tessuto. Un campo in cui sta avvenendo questa trasformazione è la connettomica: la mappatura delle connessioni neurali in grandi volumi di tessuto cerebrale digitalizzato.
Morgan and Lichtman BMC Biology (2017) 15:101
DOI 10.1186/s12915-017-0436-9
https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-017-0436-9
Josh L. Morgan 1* e Jeff W. Lichtman 2*
- Corrispondenza: jlmorgan@wustl.edu; jeff@mcb.harvard.edu
- Dipartimento di oftalmologia e scienze visive, neuroscienze, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63108, USA
- Dipartimento di biologia molecolare e cellulare, Center for Brain Science, Harvard University, Cambridge, MA 02138, USA
Dai disegni alla digitalizzazione: l’emergere delle immagini come dati
In termini di immagine del mondo, il passaggio dalla pittura alla fotografia è stato un passaggio profondo poiché l’immagine è diventata, per la prima volta, una resa oggettiva del mondo. In nessun luogo questo cambiamento è stato più evidente che in microscopia. Nei primi secoli dopo la costruzione dei microscopi, gli scienziati hanno disegnato il mondo nuovo e precedentemente invisibile sulla base delle loro impressioni. Di conseguenza, scienziati formidabili come Golgi e Cajal potevano guardare lo stesso tipo di materiale e riferire cose diverse. Questo problema interpretativo è stato in parte superato dall’invenzione della camera oscura e successivamente della camera lucida, che ha permesso ai microscopisti di tracciare esattamente ciò che si stava osservando (Fig. 1a). Ma l’abilità del tracciante era ancora un ostacolo per ottenere informazioni affidabili.
Lo sviluppo di cristalli di alogenuro d’argento fotosensibili come mezzo per la cattura e l’archiviazione di informazioni visive (Fig. 1b) ha segnato un punto di svolta nella scienza biologica. Ha permesso a molte persone, che potrebbero non essere d’accordo, di interpretare almeno gli stessi dati. La fotografia è fiorita nel secolo scorso e la fotomicroscopia è diventata una caratteristica centrale di quasi tutte le pubblicazioni relative alla biologia delle cellule, che è una vasta letteratura.
L’avvento della televisione segnò la nascita dell’immagine “elettronica”. In microscopia, gli amplificatori di luce che erano stati utilizzati nell’esercito per l’imaging in condizioni di scarsa illuminazione sono stati combinati con telecamere in stile TV e metodi di fluorescenza ad alto rapporto segnale/rumore per rendere gli eventi cellulari nel tempo in cui l’intensità assoluta del campione era, fino ad allora, limitante. L’immagine elettronica analogica è stata un progresso profondo in quanto potrebbe essere regolata, ad esempio, per modificare il contrasto o la gamma dell’immagine in modi riproducibili [1]. Segnò anche la nascita di immagini sintetiche in cui un percorso ottico che producesse un’immagine “reale” non era più un requisito. Pertanto, il microscopio elettronico a scansione, l’invenzione iniziale di Minsky del confocale, o l’invenzione di Roberts e Young del microscopio a spot volante, tutti producevano immagini di microscopia riproducendo dati di immagine ottenuti in serie da un rivelatore a punto singolo su un dispositivo distribuito nello spazio come un monitor TV (Fig. .1c) [2, 3]. Questa scansione è stata un importante progresso perché l’immagine era ora una serie puntillistica di valori di dati, ciascuno indipendente e misurabile separatamente, il precursore della vera microscopia digitale. Questo approccio ha permesso di acquisire le prime immagini digitali (Fig. 1d). A partire dagli anni ’90, la commercializzazione dei computer e l’aumento esponenziale della loro potenza hanno portato a un’altra rivoluzione nell’imaging biologico, che è ancora in corso e che riteniamo importante quanto il passaggio dal disegno alla fotografia. I dispositivi di imaging elettronico possono ora trasmettere grandi quantità di dati di immagine direttamente all’archiviazione del disco rigido. L’acquisizione dei dati di immagine si è quindi separata dalla resa delle immagini con profonde conseguenze.
Una di queste conseguenze è che è possibile acquisire quantità molto maggiori di dati di immagine rispetto a quanto fosse possibile con la pellicola.
Questo particolare tipo di “big data” sta già avendo un grande effetto sulla microscopia biologica. In effetti, stiamo raggiungendo il punto in cui l’imaging, l’archiviazione e il recupero dei dati dell’immagine digitale, è così facile che giustifica una ripresa prima di porre domande e poi di avvicinarsi alla microscopia. Di conseguenza lo stile di lavoro dei microscopisti cambierà. Piuttosto che cercare campioni di tessuto per trovare immagini di esempio per fare un punto particolare, i vasti dati dei campioni biologici digitalizzati verranno estratti dopo, a volte molto tempo dopo, l’acquisizione dell’immagine. Questi grandi set di dati sono anche condivisibili, dando potenzialmente a qualsiasi parte interessata l’accesso a interi tessuti piuttosto che solo a immagini di esempio. La raccolta di massa e la distribuzione di massa dei dati biologici offrono opportunità senza precedenti sia per raggiungere il consenso sia per l’esame collaborativo dei dati per rilevare modelli complessi o rari che altrimenti sarebbero impossibili da trovare.
Qui è mostrato lo Zeiss Ultraphot I, il primo fotomicroscopio commerciale dell’azienda (per gentile concessione di Carl Zeiss Microscopy GmbH). c) Il primo microscopio confocale a scansione descritto da Marvin Minsky nel suo brevetto del 1957 [28]. Questo dispositivo utilizzava elettromagneti (vedi etichette 46 e 54) per spostare un campione (11a) in uno schema raster. Il campione è stato illuminato con un punto luminoso focalizzato e la luce riflessa di ritorno è passata attraverso un foro stenopeico ed è stata rilevata da un tubo fotomoltiplicatore (PMT). L’uscita analogica del PMT è stata visualizzata su un oscilloscopio. d La prima immagine digitale mostra Walden Kirsch nel 1957 (in basso a destra), figlio del caposquadra che ha costruito il primo scanner di immagini [29]. L’immagine è la somma di due scansioni binarie impostate a soglie diverse per produrre livelli di grigio approssimativi. Questo pannello mostra anche un’immagine della fotocamera digitale che lo stesso Walden ha preso 40 anni dopo di sua figlia a una risoluzione molto più alta dei 176 × 176 pixel dell’immagine di lui e una profondità di 24 bit piuttosto che la profondità binaria (1 bit). © 1998 IEEE. Ristampato, con il permesso, da Kirsch RA. SEAC e l’inizio dell’elaborazione delle immagini presso il National Bureau of Standards. IEEE Ann History Comput. 1998;20(2);7–13; tutti i diritti riservati
Riteniamo che grandi volumi di dati di immagini digitali tridimensionali saranno particolarmente utili per lo studio dell’organizzazione cellulare del cervello, il tessuto più complesso conosciuto. Poiché le reti neuronali spazialmente estese sono la base delle funzioni del cervello, la descrizione di tali reti richiede l’accesso a versioni digitali di grandi volumi di tessuto ma a risoluzioni sufficienti per risolvere i dettagli sinaptici subcellulari, in altre parole, i big data.
Una visione big data del cervello: i connettomi
Alla fine del XIX secolo, mentre Ramon y Cajal stava elaborando la sua ‘dottrina del neurone’ [4], Charles Sherrington cominciava a identificare discontinuità fisiologiche nel flusso di informazioni che mediavano comportamenti riflessivi che attribuiva a ‘sinapsi’ tra assoni e i loro obiettivi [5]. Le idee di Sherrington hanno trovato un forte correlato anatomico nel lavoro di Cajal sulla legge della polarizzazione dinamica (Fig. 2). Deve essere stato un grande momento in cui i mondi della fisiologia e della neuroanatomia hanno colto l’idea che stavano in effetti studiando la stessa cosa, le sinapsi, da prospettive diverse. L’idea che la connettività fisica dei neuroni possa essere alla base della funzione neurale è stata la grande sintesi della neurobiologia del XX secolo.
Nonostante gli inizi promettenti in anatomia e fisiologia, i collegamenti concettuali tra le connessioni cellulari e il comportamento forse non si sono evoluti quanto si sarebbe potuto sperare. Molte scoperte moderne, infatti, sembrano enfatizzare quasi l’idea opposta: che la connettività anatomica di per sé è una piattaforma inadeguata per comprendere il comportamento di un organismo [6]. Ad esempio, il fatto che le sinapsi possano rafforzarsi o indebolirsi o addirittura tacere; il fatto che gli effetti ormonali e paracrini possono modificare il comportamento di un circuito neurale; e il fatto che lo stato comportamentale di un organismo possa cambiare rapidamente suggerisce che lo schema elettrico è insufficiente per raggiungere le basi fisiche di un cervello funzionante [7].
Ma questi avvertimenti non sono la ragione principale per cui le reti sinaptiche non sono state studiate in modo approfondito. Piuttosto, per la maggior parte, tali dati semplicemente non erano disponibili. Il motivo principale è tecnico: le mappe di connessione delle reti richiedono immagini ad alta risoluzione su grandi volumi, un mix impegnativo [8]. Tuttavia, sembra che le neuroscienze siano sul punto di entrare in un momento in cui informazioni dirette e dettagliate sulla connettività di rete saranno prontamente disponibili grazie ai recenti sviluppi nelle tecnologie di imaging che rivelano l’organizzazione della rete neurale.
Sebbene la connettomica sia un campo nascente, la ricerca si sta già muovendo in diverse direzioni. Può essere utile dividere formalmente la mappatura dei dati connettivali in quattro categorie connettomiche —proiettiva, interclasse, intraclasse e saturata (Fig. 3)—perché questi corpi di lavoro pongono tipi di domande molto diversi e in una certa misura richiedono tecniche diverse.
Connettomica proiettiva
Il cervello è diverso da altri sistemi di organi perché le cellule principali (neuroni) interagiscono specificamente con un gran numero di altre cellule che possono trovarsi a distanze considerevoli (anche metri di distanza negli animali di grandi dimensioni). Pertanto, è essenziale mappare i percorsi attraverso i quali sono collegati i neuroni nelle diverse parti del cervello. Tali connessioni a lungo raggio (Fig. 3a) sono più facilmente mappabili con metodi che possono coprire grandi estensioni come le tecniche di risonanza magnetica [9] o l’etichettatura mediante trasporto assonale [10]. Nel 2005 è stato coniato il termine connettoma [11] per riferirsi a una proposta mappatura completa della matrice di connettività del cervello umano. I progressi su “The Human Connectome Project” hanno fornito un quadro per l’integrazione di molti diversi tipi di dati di imaging del cervello umano provenienti da molti soggetti diversi e hanno portato a una parcellizzazione sempre più dettagliata delle regioni del cervello umano e della loro connettività [12]. È importante sottolineare, tuttavia, che l’attuale risoluzione limite delle tecniche che mappano il cervello umano completo è dell’ordine di un millimetro cubo, un trilione di volte più grande della risoluzione richiesta dalle tecniche utilizzate per generare mappe di connettività sinaptica.
Connettività interclasse
Il cervello è anche diverso da altri sistemi di organi a causa della pura diversità dei suoi componenti cellulari. In molti animali la questione della diversità delle cellule neuronali è in qualche modo semplificata perché sembra che la stessa classe di neuroni sia usata più volte nel sistema nervoso di un singolo animale. Non solo le classi di cellule singole, ma anche i motivi multicellulari (Fig. 3b) sembrano essere usati ripetutamente. L’uso di insiemi cellulari stereotipati è comune in tutti gli organi (per esempio, il nefrone renale) dove la ridondanza intrinseca di copie multiple dello stesso insieme migliora la capacità funzionale.
Nel cervello, più copie sembrano svolgere un ruolo diverso. Nel sistema visivo, ad esempio, gli stessi motivi cellulari vengono duplicati più volte per analizzare ogni posizione nello spazio visivo. Non c’è nulla di ridondante in questa duplicazione (il danno a una piccola parte della retina porta a un punto cieco). Tuttavia, imparare come i segnali visivi vengono trasmessi dai fotorecettori ai loro bersagli a valle in una zona della retina è spesso sufficiente per spiegare come tali segnali vengono elaborati nella maggior parte della retina. È diffusa la convinzione, non ancora dimostrata, che un circuito stereotipato in modo simile possa essere utilizzato in tutta la corteccia cerebrale.
Una sfida nella generazione e nell’interpretazione dei dati del connettoma di tipo cellulare riguarda il processo di classificazione del tipo di cellula di per sé. Le cellule appartengono a più classi sovrapposte a seconda, in parte, che il criterio sia funzionale, strutturale o biochimico. Mentre cerchiamo di creare strutture logiche posizionando le cose in nicchie separate, la vera “logica” dell’evoluzione animale non richiede una struttura di classificazione così ordinata affinché un sistema nervoso svolga il suo lavoro.
Le linee tra le categorie neuronali fisse possono essere particolarmente sfocate quando la funzione di un particolare neurone è una proprietà emergente che si manifesta solo dopo un lungo periodo di sviluppo e apprendimento [13].
Connettomica intraclasse
Al di là dell’identificazione delle classi cellulari e della loro connettività canonica c’è un problema più sottile che è facilmente riscontrabile considerando la connettività della corteccia cerebellare.
Il cervelletto appare relativamente semplice: esiste un solo tipo di output assonale (dalle cellule di Purkinje) e due tipi di input assonali (fibre muschiose e rampicanti).
All’interno del cervelletto ci sono solo una manciata di tipi di cellule (cellule granulari, cellule di Purkinje e diversi tipi di interneuroni). La connettività (in senso canonico) è stata elaborata, ma sia ciò che fa esattamente il cervelletto sia come lo fa rimangono sfuggenti. Perchè è questo?
Il modo in cui funziona il cervelletto dipende probabilmente da come sono organizzate le fibre rampicanti, le fibre parallele e i neuroni inibitori che innervano le cellule di Purkinje. Non è sufficiente sapere che entrambe le classi di assoni innervano le cellule di Purkinje. Ciò che presumibilmente conta è quali particolari neuroni di ciascuna di queste classi coinnervano la stessa cellula di Purkinje. Comprendere questo tipo di connettività di rete è difficile perché potrebbero non esserci marcatori molecolari intrinseci per aiutare a discriminare una fibra parallela da una qualsiasi delle forse centinaia di milioni di altre fibre parallele nello stesso cervelletto.
Probabilmente parte di questa variazione di connettività è stabilita dagli effetti dell’attività neurale. Quindi, sospettiamo che sia principalmente nel connettoma intraclasse (Fig. 3c) dove si troveranno i modelli connettivi alla base dei ricordi a lungo termine.
Connettomica satura: un cervello digitale
Un singolo set di dati potrebbe contenere informazioni di connessione proiettiva, canonica e intraclasse (Fig. 3d) se si volesse (e si potesse) generare una vera rappresentazione digitale di un cervello contenente tutto fino all’ultima sinapsi (o anche oltre ogni vescicola sinaptica ). Il punto importante è che un cervello digitale (Fig. 3e) con uno schema elettrico completamente saturo è più utile di un vero cervello in modo critico: può essere estratto per sempre in virtù della conversione del tessuto in un equivalente digitale permanente.
Dall’inferenza delle reti sinaptiche all’immaginarle
A partire dall’uso della macchia di Golgi da parte di Cajal, i neuroscienziati hanno perseguito strategie sempre più sofisticate per scoprire i circuiti neurali che sono alla base delle caratteristiche funzionali del sistema nervoso. Per Cajal la strategia chiave consisteva nell’usare un colorante che marcasse un piccolo numero di cellule in un dato pezzo di tessuto. Con questo strumento è stato in grado di identificare tipi distinti di cellule in base al loro aspetto e, sulla base delle strette vicinanze anatomiche degli assoni di un tipo di cellula e dei dendriti e dei somi di altri, ha potuto dedurre quali tipi di cellule erano probabilmente collegati funzionalmente. Finché è stato possibile identificare un tipo di cellula da un campione di tessuto all’altro, tutte le connettività osservate raccolte dai diversi campioni di tessuto potrebbero essere amalgamate in una visione completa di come la classe cellulare ha interagito con le cellule di altre classi.
Un bel disegno di Cajal che descrive i circuiti di una regione del cervello non è un singolo pezzo di tessuto osservato attraverso il suo microscopio; piuttosto è un insieme di un gran numero di osservazioni legate inferenziale tra loro da punti in comune tra i singoli soggetti (Fig. 4a).
Nonostante una gamma in espansione di nuovi approcci di etichettatura e registrazione, in gran parte la neuroscienza genera ancora mappe di reti sinaptiche basate sull’accrescimento da osservazioni di una piccola porzione della rete in ciascuno dei molti campioni diversi. I circuiti compositi sono elevati allo status di circuiti “canonici” una volta che sembrano avere proprietà coerenti tra individui e in alcuni casi tra specie.
Cosa manca ai circuiti canonici?
Il problema con l’uso di circuiti canonici come descrittore del modo in cui il cervello è organizzato è che la struttura del tessuto neurale probabilmente non è effettivamente canonica.
La nozione di circuiti canonici è importante perché fornisce un elenco dei tipi di cellule che compongono i circuiti reali e quale tipo è collegato a quale altro tipo, ma sospettiamo che la descrizione sia, nella maggior parte dei casi, ben lontana da una rete neurale reale . I circuiti canonici spesso ignorano il numero di diverse cellule di ciascuna classe che convergono su una cellula postsinaptica e il numero di diverse cellule bersaglio di una classe che sono innervate da un assone. Più problematico, fanno l’assunto implicito che tutte le celle della stessa classe abbiano la stessa connettività in modo che mostrare la connettività media tra due tipi di celle sia un surrogato sufficiente per mappare l’insieme. Ma cosa succede se le differenze tra la connettività all’interno di coorti di cellule della stessa classe sono importanti per la funzione del circuito? Cosa succede quando le connessioni sinaptiche di una classe di neuroni si individuano in risposta a differenze nei modelli di attività all’interno di un’altra classe di neuroni?
Riteniamo che il problema con le descrizioni dei circuiti canonici diventi chiaro quando consideriamo il motivo per cui i sistemi nervosi in molti animali (e in particolare nei vertebrati) scelgono di utilizzare lo stesso tipo di cellula molte migliaia o addirittura milioni di volte. Come accennato in precedenza, l’aggiunta di più celle dello stesso tipo aumenta la potenza di calcolo del sistema solo se ogni cella o motivo è in grado di integrare informazioni leggermente diverse. Questa divisione del lavoro computazionale all’interno di una classe di cellule può derivare da una differenziazione in gran parte dipendente dall’esperienza nella loro connettività.
Questa diversità di circuiti intraclasse semplicemente non può essere catturata in viste canoniche dei circuiti cerebrali.
Mentre parte della diversità nella connettività tra cellule della stessa classe può essere prodotta da variazioni casuali o dalla distribuzione topografica delle cellule rispetto a potenziali partner, anche l’attività dei circuiti svolge un ruolo importante ricablando i circuiti neurali in fase di sviluppo.
Questo rimodellamento basato sull’attività di rete è talvolta considerato un modesto perfezionamento che si verifica alla fine dello sviluppo, come l’ultima opportunità per la messa a punto di uno schema elettrico altrimenti utilizzabile. Ma nei mammiferi, almeno, il ruolo dell’attività nell’influenzare il cablaggio può essere più centrale di quanto suggerisca la nozione di regolazione fine. L’ampio rimodellamento sinaptico postnatale sembra fondamentale per il cablaggio dei circuiti in tutto il sistema nervoso [14-22]. In luoghi come il sistema neuromuscolare, i cambiamenti nel cablaggio non possono essere considerati perfezionamenti in quanto oltre ~ 90% delle sinapsi presenti alla nascita vengono eliminate durante lo sviluppo [23].
Quando la connettività di un neurone viene modificata come conseguenza dell’attività di altri membri della stessa popolazione neurale, emergeranno modelli di connettività di rete di ordine superiore che non possono essere catturati da un approccio canonico (da tipo a tipo) alla ricostruzione del circuito. Questi modelli di connettività intraclasse sono visibili solo quando i modelli di connessione di molti neuroni nello stesso pezzo di tessuto sono mappati contemporaneamente. In modo critico, le mappe di molte cellule nello stesso pezzo di tessuto sono in grado di rivelare la proprietà della contingenza: il neurone A innerva il neurone C solo se lo fa anche il neurone B. Quando il modello di convergenza intraclasse di una dozzina di motoneuroni in via di sviluppo viene mappato utilizzando Brainbow, vediamo una grande quantità di questo tipo di cablaggio di contingenza (Draft, Turney e Lichtman non pubblicati). Questi modelli ordinati di connettività non potrebbero mai essere dedotti campionando uno o due neuroni alla volta. Quindi, per capire come le popolazioni di neuroni si organizzano in circuiti, non è sufficiente osservare la connettività di una cellula e dedurre la sua relazione con una rete teorica standardizzata. Piuttosto, tutte le cellule, o almeno molte di esse, devono essere analizzate nello stesso pezzo di tessuto per apprendere l’effettiva struttura della rete dei neuroni interconnessi. Ribadisco: è possibile che le informazioni apprese (come una particolare lingua) siano memorizzate in modo invisibile a livello di circuiti canonici.
Etichetta tutto, immagina tutto
Come suggerito sopra, un’alternativa al metodo di accrescimento per ricostruire circuiti da molti campioni diversi consiste nell’acquisire molte o tutte le reti sinaptiche dallo stesso campione di tessuto. Nel neuropilo denso del sistema nervoso centrale o nei processi fini nei sistemi nervosi degli invertebrati, una descrizione anatomica completa della connettività sinaptica è forse più facilmente ottenuta con la microscopia elettronica seriale (EM; Fig. 4b). L’alto potere risolutivo dei microscopi elettronici significa che il tessuto può essere colorato con etichette non specifiche che rivelano ogni membrana cellulare e ogni organello. Tale colorazione non specifica rende la microscopia elettronica fondamentalmente diversa dalla maggior parte degli usi della fluorescenza perché tutte le cellule e gli organelli sono visibili nello stesso pezzo di tessuto. Inoltre, se si genera una mappa di rete di tutte le celle che si trovano all’interno del volume, tale mappa di rete rivela dettagli del circuito che non possono essere dedotti da un numero qualsiasi di insiemi di dati scarsamente annotati [7]. La morfologia e l’ultrastruttura di ciascun processo connesso forniscono anche dettagli che possono essere utilizzati per classificare i tipi e valutare i punti di forza delle connessioni all’interno delle reti.
La capacità di vedere tutto ha un costo: ridimensionare l’approccio della microscopia elettronica anche a volumi di dimensioni moderate non è banale. Con poche eccezioni, i primi approcci di microscopia elettronica seriale utilizzavano volumi di tessuto molto più piccoli dell’albero dendritico del neurone di mammifero medio. Molti ostacoli tecnici ancora ostacolano l’acquisizione di set di dati EM di grandi volumi, dalla difficoltà di fissare, colorare e incorporare in modo uniforme grandi pezzi di tessuto alle sfide dell’imaging di grandi campi visivi con una risoluzione adeguata in una scala temporale compatibile con il durata della vita umana (molto meno la durata di una borsa di studio universitaria o postdoc). Il problema risiede nell’esigenza congiunta di grandi volumi e alta risoluzione. Affinché le piccole strutture, come le vescicole sinaptiche, i rami sottili degli assoni e i colli delle spine dendritiche siano visibili e tracciabili, i voxel dell’immagine (cioè l’equivalente tridimensionale dei pixel) devono essere più piccoli della dimensione di queste strutture. A seconda della tecnica utilizzata per sezionare e visualizzare il tessuto, la dimensione di un voxel EM seriale varia da circa 500 nm 3 in su. Nella nostra esperienza, circuiti e sinapsi nel cervello di topo possono essere identificati e tracciati con poca ambiguità ad una risoluzione di 4 nm × 4 nm × 30 nm [24]. A questa risoluzione, un cubo di tessuto largo cento micron (abbastanza grande da catturare circa 50 neuroni somi ma solo parti di un albero dendritico neuronale) è costituito da circa 2 × 1012 voxel (o circa 2 terabyte di dati), un cubo largo millimetri di tessuto sarebbe costituito da 2 × 1015 voxel (2 petabyte), un intero cervello di topo sarebbe di circa 2 × 1018 voxel (2 exabyte) e un intero cervello umano sarebbe di circa 2 × 1021 voxel (2 zettabyte).
I due terabyte di memoria necessari per contenere anche il più piccolo di questi volumi è qualcosa che non era disponibile per i primi 50 anni di microscopia elettronica.
Due zettabyte sono una parte consistente del contenuto digitale stimato di 2,7 ZB del mondo ed è probabilmente almeno al momento un obiettivo irraggiungibile.
Tuttavia, ora è possibile memorizzare ed elaborare 100 terabyte o più di dati digitali (si veda, ad esempio, [13]).
Il risultato è che sembra possibile, per la prima volta, studiare le reti sinaptiche di un pezzo di tessuto di dimensioni ragionevoli (centinaia di micron su un lato) a qualsiasi risoluzione arbitraria dal vedere e contare le vescicole sinaptiche a un estremo per vedere interi sistemi nervosi all’altro. Naturalmente, l’acquisizione di tali set di dati dipende non solo da un’archiviazione digitale sufficiente, ma anche da molti altri progressi tecnici che aumentano la velocità di acquisizione, elaborazione e analisi delle immagini. Sono in fase di sviluppo nuove tecnologie che aumentano la produttività e l’affidabilità dell’imaging al microscopio elettronico. Ad esempio, i nostri sforzi recenti utilizzando ATUM-SEM hanno prodotto circa un terabyte al giorno di dati EM ad alta risoluzione per set di dati di circa 100 terabyte [13, 25]. Queste prestazioni vengono migliorate di oltre un ordine di grandezza con nuove strategie di imaging che potrebbero visualizzare set di dati in millimetri cubi (petascala) dall’inizio alla fine nel giro di pochi mesi [26].
L’esplorazione di questi set di dati, che consistono in trilioni di voxel e migliaia di piani immagine, non può più essere descritta con precisione come guardare un’immagine. Piuttosto, si può investigare un pezzo di tessuto digitale come se fosse un vero cervello, proprio come si può viaggiare ovunque nella Terra digitale semplicemente con l’aiuto di un browser. È importante sottolineare che l’idea che l’investigatore abbia visto l’intero set di dati diventa impossibile. Le immagini a piena risoluzione di un millimetro cubo di cervello richiederebbero più di un secolo per essere visualizzate.
Fare biologia sui tessuti digitali
Per trasformare il tessuto digitalizzato in scala di grigi in dati di rete sinaptica, è necessario prendere decisioni su quali voxel appartengono a quali cellule e quali cellule formano sinapsi tra loro. Mentre gli esseri umani sono bravi in questo compito, un essere umano che fissa un quadrato di 1000 × 1000 pixel che cambia a una velocità di 30 fotogrammi al secondo sarà in grado di visualizzare meno di un terabyte di dati in un giorno di 8 ore. Cioè, come già accennato, i volumi EM possono già essere acquisiti più velocemente di quanto una persona possa guardare tutti i voxel acquisiti, tanto meno analizzarli. L’utilizzo di terabyte di tessuto digitale richiede quindi strategie di analisi delle immagini diverse rispetto a quelle utilizzate in passato con i dati di immagini biologiche.
Analizza tutto
Idealmente, ogni voxel di un pezzo di tessuto digitale conterrebbe non solo il valore grigio dei dati grezzi, ma anche dati di annotazione che descrivono a quale cellula (e struttura subcellulare) appartiene il voxel e, se si tratta di una sinapsi, alcuni dati di connettività ( Fig. 5a-c). Come accennato, gli umani sono molto bravi a riconoscere i confini delle cellule, classificare gli oggetti e costruire mappe di connessione. Sfortunatamente, la segmentazione di grandi volumi di dati richiede il reclutamento di un gran numero di persone per assegnare i voxel agli oggetti cellulari. Man mano che emergono nuovi strumenti che acquisiscono dati a velocità ancora più elevate, il costo per assumere in proporzione più traccianti umani sarà proibitivo. In definitiva, le soluzioni di segmentazione dovranno adattarsi ai progressi nella capacità di acquisizione delle immagini e ciò richiederà metodi di segmentazione automatizzati. Metodi che in linea di principio segmenteranno ogni voxel in un tessuto digitale.
Per le immagini EM, gli attuali algoritmi di segmentazione automatizzata sono impegnativi dal punto di vista computazionale e richiedono ancora la correzione umana dei risultati. L’obiettivo di limitare l’editing umano a quasi nulla è ancora lontano, ma i progressi in questo campo sono rapidi. Man mano che gli algoritmi migliorano e la velocità di elaborazione diventa più economica, gli algoritmi dovrebbero essere in grado di sostituire la stragrande maggioranza della segmentazione umana.
Esplorazione mirata
Le potenziali limitazioni nella segmentazione automatica mettono in luce la questione se sia effettivamente utile acquisire grandi volumi di tessuto digitale se alla fine verrà analizzato solo un sottoinsieme dei voxel dell’immagine. La mappatura ultrastrutturale anche di un singolo neurone richiede l’acquisizione di grandi volumi EM semplicemente a causa delle lunghe distanze percorse dai processi neuronali. Ma se segmentare ogni voxel all’interno di un volume non è pratico, indirizzare la ricostruzione a un sottoinsieme delle cellule può comunque produrre importanti risultati biologici. Criticamente, questo approccio è distinto dalla tradizionale mappatura dei circuiti sparsi perché, dopo un primo ciclo di tracciamento, ulteriori cellule nello stesso tessuto digitale possono essere progressivamente aggiunte alla stessa rete in base alla loro connettività sinaptica.
Un esempio di segmentazione mirata sarebbe identificare prima un corpo cellulare di un neurone bersaglio in base alla tipizzazione cellulare ultrastrutturale, all’etichettatura dell’anticorpo o alla precedente caratterizzazione ottica del tessuto. L’albero dendritico della cellula bersaglio verrebbe quindi tracciato e tutte le sue sinapsi annotate. I bottoni sul lato presinaptico di ciascuna delle sinapsi servirebbero quindi come punti di partenza per il livello successivo di tracciamento. Tracciare queste connessioni di primo ordine rivelerebbe la distribuzione spaziale, la convergenza e possibilmente la divergenza degli input assonali rilevanti della cellula. Ciascuno di questi assoni tracciati potrebbe quindi essere utilizzato per identificare tutte le cellule del tessuto che condividono gli input con la cellula bersaglio originale. Muovendosi in questo modo attraverso la connettività di rete, è possibile conoscere l’organizzazione in rete di una parte del circuito tracciando solo una piccola percentuale del volume acquisito. Una volta identificata una rete di interesse all’interno di un volume, è possibile caratterizzare i dettagli morfologici e ultrastrutturali dei suoi neuroni. Abbiamo trovato questo approccio, di tracciamento della rete mirata e caratterizzazione strutturale, per essere efficace nel mappare le interazioni sinaptiche tra i canali visivi nel talamo del topo [13] (Fig. 5b, c).
In definitiva, il numero di domande che possono essere poste su un grande pezzo di tessuto digitale supera quello che può essere chiesto da uno scienziato o anche da un singolo laboratorio. Il miglior uso di grandi insiemi di dati EM sarà quindi ottenuto rendendo questi set di dati facilmente disponibili in modo che molti ricercatori possano esplorarli. In particolare, il mantenimento di tutte le segmentazioni pubblicate in un database accessibile consentirà di rispondere alle domande sollevate da un ciclo di tracciamento e pubblicazione in un altro ciclo. Man mano che gli algoritmi automatizzati migliorano, sempre più di questi database pubblici potrebbero includere annotazioni automatizzate su larga scala dei dati che possono essere ricercati in base alla morfologia e alla connettività.
Rianimare il tessuto digitale
Sebbene abbiamo descritto questi nuovi set di dati di grandi volumi come “tessuti digitali”, ovviamente non è strettamente corretto in quanto non sono biologicamente attivi. Alla luce degli sforzi su larga scala per creare modelli di tessuto neurale funzionante [27], forse sarebbe più accurato descrivere questi volumi come tessuto digitale fisso. Tuttavia, se vengono annotati grandi volumi di circuiti neurali, completi di morfologie cellulari, connettività sinaptica e ultrastruttura, quanto sarebbe grande il salto rianimare questo tessuto? Cosa accadrà quando potremo applicare le tecniche di modellazione funzionale, attualmente utilizzate per studiare i circuiti neurali statisticamente dedotti, alla struttura anatomica dettagliata di un vero circuito neurale?
C’è un notevole dibattito su quanto un circuito così ricostruito digitalmente possa essere in grado di ricreare il comportamento del circuito originale [7]. Ad esempio, per osservare un’elaborazione biologicamente realistica in questo tessuto neurale, sarà necessario fornire un’attività biologicamente realistica agli ingressi del circuito. Tuttavia, vincolando il comportamento di un modello anatomicamente realistico su larga scala di un circuito in base ai risultati dell’imaging su larga scala dell’attività del circuito e delle regole di apprendimento, potremmo essere in grado di generare circuiti funzionali. Quanto il comportamento di questi circuiti assomigli al funzionamento dei circuiti biologici sarà un test critico per la nostra comprensione dell’elaborazione neurale.
Conclusione
Sia le neuroscienze cellulari che quelle dei sistemi stanno facendo progressi costanti, ma il ponte fondamentale tra di loro, la comprensione di come un gran numero di neuroni si organizzano in reti funzionali, è ancora da costruire. Il passaggio dall’essere in grado di visualizzare uno o due neuroni alla volta alla capacità di digitalizzare intere reti multi-neuronali potrebbe essere la soluzione. Nell’esplorare reti densamente ricostruite, saremo in grado di affrontare la diversità nella connettività dei neuroni non come rumore da mediare, ma come i principali fenomeni da comprendere.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NINDS (High Resolution Connectomics of Mammalian Neural Circuits, TR01 1R01NS076467 e 1U01NS090449-01) e dal NIMH Silvio Conte Center (1P50MH094271), IARPA via DoI/IBC (D16PC00002), MURI Army Research Office (numero di contratto W911NF1210594 e IIS-1447786).
Contributi degli autori
Entrambi gli autori (JM e JL) hanno scritto, letto e approvato il manoscritto finale.
Interessi conflittuali
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
References
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